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丙二醛含量試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-157

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

氧自由基作用于脂質的不飽和脂肪酸，生成過氧化脂質；后者逐漸分解為一系列復雜的化合 物，其中包括 MDA。通過檢測 MDA 的水平即可檢測脂質氧化的水平。

測定原理：

MDA 與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產物，在 532nm 有最大吸收 峰，進行比色后可估測樣品中過氧化脂質的含量；同時測定 600nm 下的吸光度，利用 532nm 與 600nm 下的吸光度的差值計算 MDA 的含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾 水。

試劑的組成和配置：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

注意事項：

臨用前注意試劑一是否完全溶解 ，如未溶解，可以 70℃-90℃加熱，并振蕩以促進溶解。

MDA 提取：

1 、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2 、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、吸取 0.6mL  試劑一于 1.5mL 離心管中，再加入 0.2mL 樣本,  混勻。

2 、95℃水浴中保溫 30min（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻， 10000g，25℃, 離心 10min。

3、吸取上清液于 1mL 玻璃比色皿中，測定 532nm 和600nm 處的吸光度，記為 A532 和 A600， ΔA= A532-A600。

MDA 含量計算：

1、血清（漿） 中 MDA 含量的計算：

MDA 含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷V 樣

=25.8×ΔA

2、細菌、細胞或動物組織中 MDA 含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

MDA 含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V 樣)

=25.8× ΔA÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。

（2）按照樣品質量計算

MDA 含量(nmol/g  鮮重)=[ ΔA×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)

=25.8×ΔA ÷W

（3）按照細菌或細胞密度計算：

MDA 含量(nmol/10⁴)=[ ΔA×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)

=0.0516×ΔA

V 反總：反應體系總體積，  8×10^-4  L；ε：丙二醛摩爾消光系數， 155×10³  L / mol /cm；d：  比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.2 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL；Cpr： 樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g； 500：細胞或細菌總數，500 萬。